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Detecção de antigénios virais de PRRS
Pode-se conseguir um diagnóstico definitivo de PRRS em porcos doentes através da detecção de lesões microscópicas características de PRRSv junto com a demostração de antigénio viral nos tecidos com lesões. Para detectar antigénio(s) de PRRSv nos tecidos pode ser utilizada a fluorescência de anticorpos (FA) ou imunohistoquímica (IHC) em secções de tecido congelado (figura 1). Estas provas combinam-se com anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para PRRSv. O exame de FA directo em secções de tecido congelado é barato e rápido. É específico mas nem sempre é muito sensível. Os resultados são especialmente afectados pela qualidade do tecido (por ex: autolise). Em troca, a IHC é útil para detectar antigénio viral em tecidos fixos com formalina. A IHC é mais sensível que a FA directa, mas implica mais tempo e é mais cara que a FA.
Figura 1. Antigénio de PRRSv detectado no tecido.
Para a FA directa devem ser enviados tecidos frescos ou congelados e, quando enviados para IHC, têm que ser fixados em formalina neutra tamponada a 10%. No entanto, a fixação prolongada de tecidos em formalina é prejudicial para uma detecção eficaz de antigénios mediante IHC. Se for esperado um atraso na realização do exame, recomenda-se colocar os tecidos em álcool após a fixação com formalina. Os tecidos preferidos para estes exames são coração, rim, pulmão, linfonodos, baço, timo e amígdalas. Os antigénios de PRRSv também podem ser detectados na glândula adrenal, intestino, fígado e, por vezes, no cérebro. Ao fazer FA e IHC, podem ser utilizados anticorpos monoclonais específicos para antigénios altamente conservados entre os isolados dos E.U.A. e a Europa, ou podem ser usados anticorpos monoclonais contra epítopos menos conservados para avaliar as diferenças antigénicas entre estirpes. Se o diagnóstico de PRRS for realizado com FA ou IHC, devido à alta especificidade dos anticorpos monoclonais e à variabilidade antigénica significativa do vírus de PRRS, pode ser melhor usar mais de um anticorpo monoclonal no exame para evitar um diagnóstico errado.
Detecção de material genómico viral de PRRS
Foram desenvolvidos testes baseados na reacção em cadeia da polimerase (PCR) para detectar o ARN de PRRSv (ou seja, ácido nucleico) em amostras clínicas. Dado que o vírus não necessita ser isolado em cultura celular para detectar o ARN viral, PCR pode proporcionar, de forma mais rápida, o resultado do teste que o isolamento do vírus. Como princípio geral, considera-se que os ensaios baseados em PCR são muito sensíveis e muito específicos.
Figura 2. Detecção de material genómico viral de PRRS em amostras clínicas mediante PCR fluorogénica automatizada.
Foram desenvolvidos vários tipos de testes baseados em PCR que utilizam iniciadores específicos, complementares às sequências de diferentes fragmentos genómicos, para a detecção de materiais genéticos virais de PRRS em amostras clínicas. Em qualquer análise baseada em PCR para PRRSv, o ARN viral necessita ser extraído das amostras clínicas e transformado em ADN complementar (ADNc) usando uma enzima transcriptase inversa (RT). Posteriormente, o ADNc é amplificado exponencialmente mediante a PCR usando uma enzima Taq polimerase e iniciadores específicos do vírus. A coincidência exacta dos iniciadores, seguida pela amplificação exponencial, destina-se a produzir um teste muito sensível e muito específico. Recentemente foram desenvolvidos testes baseados na PCR fluorogénica automatizada (ou seja, RT-qPCR) para detectar material genómico viral de PRRS em amostras clínicas (figura 2). Estas PCR aplicam a amplificação numa só passagem num tubo em que sondas fluorescentes se unem ao produto da PCR à medida que ele se produz (ou seja, PCR "em tempo real"). Crê-se que as PCR fluorogénicas melhoram a fiabilidade e a consistência das RT-PCR convencionais para detectar PRRSv (figura 3).
Figura 3. PCR fluorogénica para detectar PRRSv.
Os testes baseados em PCR foram utilizados para detectar ARN de PRRSv em diferentes amostras clínicas, como fluido oral e amostras ambientais. A PCR é particularmente útil para a detecção de ARN viral em amostras de sémen ou fezes, que são citotóxicas para cultivo celular ou não podem ser avaliadas por outros métodos. Também é útil para detectar ARN de PRRSv em tecidos fetais e fluidos torácicos, ou seja, amostras onde o PRRSv pode ser inactivado facilmente por autolise. O uso de análises de PCR tornou-se mais comum tanto para o diagnóstico de PRRS como para ajudar na monitorização/vigilância (ou seja, na selecção de animais de reposição, detecção de animais portadores e programas de ensaio e eliminação) ou na biossegurança da exploração (ou seja, testes ambientais, testagem de camiões, testes de sémen).
A PCR é um exame caro em comparação com outros métodos de diagnóstico. Além disso, deve ter-se em conta que um resultado positivo de PCR indica a presença de ARN viral mas não necessariamente a presença de PRRSv infeccioso. Além disso, a realização de testes de PCR em diferentes laboratórios pode variar dependendo da condição da amostra, processamento da amostra, técnica de extracção, iniciadores utilizados, condições de ciclos térmicos e a competência e experiência do técnico que realiza o ensaio. Portanto, é importante que os laboratórios que realizam a PCR para validar os seus ensaios incluam estimativas de sensibilidade, especificidade, comparações com os standarts de referência, resultados de ensaios de aptidão e estudos experimentais ou de campo de ensaio.
