0
Métodos para detectar anticorpos de PRRSV
A imunofluorescência indirecta (IFA), a neutralização de vírus no soro (SVN), a imunoperoxidase em monocamada (IPMA) e a imunoabsorção ligada a enzimas (ELISA) têm sido utilizadas para a detecção de anticorpos específicos contra o PRRSV. Actualmente, IFA, SVN e ELISA podem-se realizar na maioria dos laboratórios de diagnóstico veterinário da América do Norte, enquanto que na Europa se utiliza muito o IPMA. Todas as provas se consideram específicas com diferentes graus de sensibilidade. Geralmente IFA, ELISA e IPMA servem para detectar anticorpos totais do isotipo IgG específico para PRRSV, enquanto que a SVN se utiliza para detectar anticorpos funcionais associados à imunidade ou protecção imunitária. A IFA e o ELISA foram adaptados para detectar outros isotipos, como IgM ou IgA (Figura 1). Os anticorpos IgG específicos para PRRSV, que se podem detectar mediante IFA, IPMA ou ELISA, produzem-se em porcos infectados entre os dias 7 e 14 após a infecção; não obstante, os anticorpos SVN podem-se detectar inclusive de 1 a 2 meses após a infecção (Figura 2). Geralmente os anticorpos contra PRRSV de infecções activas podem-se detectar de forma precisa entre 3 a 4 meses após a infecção e podem durar entre 6 meses até 1 ano após o surto.
Figura 1. Resposta de IgM em porcos jovens após uma infecção experimental com PRRSV, medida por IDEXX PRRS ELISA 2XR com modificações. Os grupos 1 e 2 foram inoculados com PRRSV tipo 2 por via intranasal no dia 0. O grupo 1 foi re-inoculado aos 196 dias pós-inoculação (dpi), enquanto que o grupo 2 não. O grupo 3 não foi inoculado com PRRSV até aos 196 dpi. Os anticorpos IgM específicos para PRRSV podem-se detectar a partir do 7 dpi e diminui rapidamente após os 14 dpi. (Nezami S and Yoon KJ, dados não publicados)
Figura 2. Resposta de anticorpos específicos contra PRRSV durante um período de tempo após a infecção experimental em porcos, medida mediante a prova de imunofluorescência indirecta (A), ensaio de imunoperoxidase em monocamada (B), prova de neutralização do vírus no soro (C) e ensaio de imunoabsorção ligada a enzimas (D). (Adaptado da publicação de Yoon K-J, et al.: Characterization of the humoral immune response to PRRSV infection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 7:305-312, 1995)
Nas provas IFA e IPMA utilizam-se, como antigene, células infectadas pelo vírus (figura 3). Uma vantagem destas provas em comparação com ELISA é que se pode determinar o título de anticorpos. Contudo, os critérios de avaliação dos títulos de anticorpos IFA, variam frequentemente entre os técnicos e os laboratórios já que a interpretação é subjectiva. Além disso, os resultados da prova ou os critérios de avaliação dos títulos de anticorpos variarão dependendo do grau em que a estirpe de PRRSV utilizada no ensaio difira antigenicamente do isolado causador da infecção.
Figura 3. Fotomicroscopia de imunofluorescência positiva numa monocamada de células MARC145 infectadas por PRRSV, incubadas com um soro suíno que contém anticorpos IgG específicos para PRRSV e tingida com anticorpos de cabra anti-IgG de porco conjugados com FITC.
Crê-se que o ELISA é mais sensível que a IFA e a IPMA. Foram descritos vários formatos de ELISA: um ELISA indirecto que utiliza um quociente amostra/positivo (M/P), um ELISA indirecto que utiliza valores de DO directos e um ELISA de bloqueio. Actualmente há vários kits de ELISA comerciais disponíveis para a detecção de anticorpos serológicos específicos para PRRSV (figura 4). A uniformidade no fabrico do kit e o alto grau de automatização na realização da prova no laboratório de diagnóstico dão lugar a uma menor variação nos resultados do kit comercial de ELISA em comparação com outros ensaios. Outras vantagens do kit comercial são: a) a detecção de anticorpos contra ambos tipos de PRRSV; b) o tempo de resposta rápido; e c) autorização. Ultimamente o sistema ELISA também se adaptou para a análise de amostras de fluido oral para detectar anticorpos de PRRSV como fazendo parte da vigilância sanitária da exploração.
Figura 4. Fotografia de uma placa IDEXX ELISA X3 que mostra resultados positivos (cor azul) e negativos (sem cor). A densidade da cor está correlacionada com o nível de anticorpos do soro, ou seja, quanto mais escura é a cor, mais alto é o título de anticorpos.
(Foto cortesia do: Dr. David Baum, Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory)
A prova SVN também se considera uma prova específica, mas estudos anteriores sugeriram que a SVN é menos sensível que a IFA e o ELISA. A baixa sensibilidade da prova deve-se, principalmente, ao facto de que os anticorpos neutralizantes contra o PRRSV se desenvolvem lentamente e tarde. Ao ser uma prova trabalhosa, é melhor considerar a SVN como uma ferramenta de investigação e não como uma prova diagnóstica de rotina. Tal como se passa com a IFA e a IPMA, os resultados da SVN são muito influenciados pelo grau de relação antigénica entre a estirpe usada na prova e o isolado causador da infecção.
Interpretação dos resultados serológicos no diagnóstico de PRRS
A serologia é útil para confirmar a presença (ou seja, a seropositividade) e o estado (por exemplo, altos níveis de anticorpos em infecções recentes) da infecção por PRRSV na exploração. A informação serológica a partir de uma só amostra não serve para diagnosticar PRRS clínico num só animal já que a infecção por PRRSV tem uma prevalência muito alta em explorações de porcos. Ao interpretar os resultados serológicos em porcos jovens, deve-se considerar a possível presença de anticorpos maternais. Também é importante ter em conta que os ensaios serológicos actuais utilizados no diagnóstico não podem diferenciar de forma rotineira entre os anticorpos induzidos pela vacina e os anticorpos induzidos pelos isolados de campo. Além do mais, registou-se a presença de possíveis falsos positivos de PRRSV inclusive com kits comerciais de ELISA. Um resultado serológico negativo para PRRS das amostras num momento pontual tem várias interpretações possíveis, como: a) os porcos não estão infectados com o vírus; b) os porcos infectaram-se recentemente com o vírus e ainda não seroconverteram; c) os porcos infectaram-se com o vírus, mas seronegativizaram; e d) o resultado foi negativo devido à baixa sensibilidade da prova ou a um erro do laboratório. Portanto, se se usa uma só amostra pontual, a serologia do PRRS deve-se utilizar juntamente com métodos válidos de amostragem de populações para determinar se uma exploração esteve exposta ao PRRSV e não para determinar se um animal está infectado.
Para determinar o estado da infecção de uma exploração por PRRSV costuma-se recomendar a análise de porcos jovens, em vez dos reprodutores. Em explorações de ciclo fechado, num só sitio, a seroprevalência de infecção por PRRSV considera-se, geralmente, mais alta que nas de engorda-acabamento. Normalmente, o soro de 10 porcos de acabamento é suficiente para determinar se a exploração esteve exposta ao PRRSV. Para os sistemas de produção multisítio, cada etapa de produção representa uma só população, pelo que cada sítio deve ser rastreado em separado. A extracção de uma série de amostras de sangue em diferentes etapas de produção é muito útil para determinar a idade em que a infecção por PRRSV é mais frequente.
O diagnóstico serológico da infecção por PRRSV, como causador de falha reprodutiva ou doença respiratória, pode-se atingir demonstrando a seroconversão com um par de amostras de soro ou uma mudança no título de anticorpos (ou seja, a elevação do título de anticorpos) num par de amostras de soro. Não obstante, as porcas podem estar expostas ao vírus duas ou mais semanas antes do aparecimento dos sinais clínicos, em que, dependendo do caso, pode não se observar o aumento dos títulos de anticorpos. A presença de anticorpos de PRRSV em fluidos fetais ou no sangue recolhido em leitões nascidos mortos e leitões débeis antes que ingiram colostro também é indicativo de infecção por PRRSV. Contudo, uma avaliação diagnóstica definitiva de PRRS relativamente à doença clínica requer que a informação serológica seja interpretada juntamente com os resultados de outros ensaios víricos.
