Guia prático para a recolha de amostras de fluídos orais

Pandemias recentes (COVID-19 em humanos e Peste Suína Africana em porcos) confirmaram a importância da informação da população para compreender e orientar efectivamente os esforços em saúde. A recolha dessas informações populacionais em porcos sempre foi problemática porque os sinais clínicos são altamente variáveis ​​e a amostragem individual é cara. No entanto, o uso de fluidos orais oferece-nos uma alternativa fácil, eficiente e económica para a vigilância epidemiológica.

Os fluidos orais são obtidos de um porco ou grupo de porcos simplesmente pendurando uma corda de algodão no parque para morderem / mastigarem e, em seguida, recuperar o fluido oral da corda molhada. Mais de 27 agentes patogénicos, incluindo a Peste Suína Africana (PSA), Peste Suína Clássica (PSC), Febre Aftosa, circovírus suíno (PCV), síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS), produzem níveis detectáveis ​​de ácidos nucleicos e / ou anticorpos específicos em fluidos orais. Hoje em dia, esse tipo de amostra é frequentemente usada nos Estados Unidos para monitorizar populações de porcos. Como exemplo, o Laboratório de Diagnóstico Veterinário da Universidade do Estado de Iowa processou cerca de 1,4 milhão de amostras de fluido oral entre 2010 e 2019.

Em primeiro lugar:

1. Qual é o objectivo sanitário a longo prazo? Como é que a vigilância pode ajudar a alcançar esse objectivo?
2. Entenda o processo: Há muitos vídeos on-line que descrevem como e porque recolher fluídos orais.

Recolha de fluídos orais:

1. Organize os materiais: Disponha de cordas, cortadores, sacos, tubos, etc, para cada edifício. Mantenha a biossegurança e evite transportar materiais de um edifício para outro.
2. Recolha as amostras de manhã cedo: Os porcos estão mais activos cedo, recolha as amostras antes de os alimentar.
3. Use a “psicología” suína: A primeira vez, permita-lhes interagir com a corda pendurada por tempo suficiente para explorar e aprender o processo (cerca de 45 minutos). Se ainda asim eles se mostram indiferentes, ponha no pavimento 1 metro de corda com nós nas extremidades durante cerca de 30 minutos. Logo que comecem a brincar com ela, arraste-a lentamente guiando-os para o sítio eleito e pendure uma nova corda para que a mastiguem. Tenha em conta que o uso de aromatizantes na corda tem oferecido um benefício muito reduzido na prática.
4. De que animais se recolhem amostras? Nos leitões antes do desmame recolhem-se amostras através da recolha dos fluídos orais familiares (porcas e leitões). Podem ser recolhidos fluídos orais individuais ou por parque de porcos de ≥ 21 dias de idade, incluídas as porcas alojadas em grupo. Podem ser recolhidos fluídos orais de varrascos e porcas alojados individualmente, mas isso requere treino (ver #3) e geralmente não é prático em grandes sistemas comerciais.
5. Siga uma rotina: Pendure a corda no mesmo local na mesma hora do dia para estabelecer uma rotina. Os porcos aprenderão rapidamente o processo e saberão exatamente o que fazer nas amostragens posteriores. Uma vez que um padrão seja estabelecido, o tempo de recolha pode ser reduzido para 20 minutos. Não deixe a corda no curral por um longo período de tempo (horas) porque (a) a amostra será perdida com o tempo à medida que a corda seca; (b) os porcos são fortes e destruirão a corda se houver tempo suficiente; (c) os porcos ficam entediados com a corda e simplesmente ignoram-na.
6. Evita o excesso de contaminação da amostra: Posicione a corda de forma que fique à altura dos ombros dos porcos, evitando que toque no solo. A matéria orgânica não afecta directamente os testes de diagnóstico (RT-PCR ou ELISA), mas quanto menos matéria orgânica a amostra contiver, mais fácil será o processamento em laboratório.
7. Use um saco ou um tubo limpo para cada amostra: Coloque a parte húmida da corda num saco plástico, escorra-a e recolha o líquido no tubo limpo que será enviado para laboratório (previamente etiquetado). Remova as cordas dos parques após cada amostragem para manter a novidade (os porcos também ficam entediados!)
8. Preserve a amostra: Arrefeça a amostra (4 ° C) colocando-a no gelo ou no frigorífico imediatamente após a recolha. Cálculos baseados em dados de Prickett et al., (2010) estimam uma meia-vida para RNA de PRRSV em fluídos orais de aproximadamente 13 horas a 30°C, 42 horas a 20°C e 14 dias a <10°C. Os anticorpos para PRRSV não foram detectados após 72 horas a 30°C.

Fluídos orais para programas de vigilância:

1. Quantas mostras devem ser recolhidas e com que frequência? Todos nós temos que seguir um orçamento. Ainda assim, algumas amostras, de 2 a 4 cordas por pavilhão (ou sala), em intervalos determinados (2-4 semanas), juntamente com os índices produtivos, fornecerão um bom relato do estado sanitário da exploração (gráfico 1 )
2. Prepare um plano para avaliar constantemente a informação: Uma boa alternativa são os diagramas de controlo de processos ou SPC.
3. Use o "fixed spatial sampling" para maximizar a detecção dentro do edificio: uma prática explicação desta metodologia pode ser encontrada on-line
   1. Amostragem de fluídos orais (em inglês).
   2. Amostragem de fluídos orais (em espanhol).
4. Espere o inesperado: Tenha um plano para verificar ou descartar resultados de diagnóstico inesperados. Por exemplo: testar novamente as mesmas amostras em duplicado, reamostrar os porcos, analisar usando outro método, etc.
5. Recorde a evolução natural das doenças para estabelecer um plano. Os testes baseados em ácido nucleico irão detectar a presença precoce do vírus, enquanto os testes de anticorpos irão detectar a resposta imunológica prolongada resultante. As duas tecnologias funcionam melhor juntas para monitorizar, por exemplo, para autorizar a libertação de animais em quarentena.

Outras considerações:

1. Zebras e cavalos… as coisas parecidas não são iguais: Amostras que podem parecer semelhantes aos fluídos orais (p.ex: zaragatoas bucais ou nasais) podem não ter a mesma taxa de detecção. Exemplos para Gripe A, Febre Aftosa, Senecavirus A e PRRSV são mostrados na tabela 1.
2. Não misture (pool) os fluidos orais e não mova as cordas de um parque para outro: Em vez de melhorar a taxa de detecção, estes processos podem dar origem a falsos negativos.
3. Evite congelar e descongelar as amostras ou fazer alterações bruscas de temperatura: Os anticorpos em fluídos orais são bastante resistentes, mas os ácidos nucléicos não são tão resistentes. Divida a amostra em várias alíquotas se precisar de vários testes. Na exploração, não armazene amostras em congeladores NoFrost, devido aos ciclos de descongelação automático flutuantes. No laboratório, descongele as amostras no frigorífico (4°C) e não em temperatura ambiente. Estas práticas têm mostrado melhor conservação de ácidos nucléicos (Weiser et al., 2018).

Tabela 1. Comparação de detecção de ácidos nucleicos em fluidos orais versus zaragatoas bucais ou nasais

nd = sem dados.

^aTaxa de positividade (média) estimada para fluidos orais recolhidos em parques versus zaragatoa bucal ou nasal. Dados recolhidos de Hole et al., (2019); Pepin et al., (2015); Romagosa et al., (2012); Senthilkumaran et al., (2017)