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O teste ELISA como instrumento de diagnóstico (2/2): Interpretar os resultados

Coisas a ter em mente ao interpretar resultados positivos ou negativos do teste ELISA.

Considerações ao interpretar os resultados:

  • Os porcos expostos a um agente patogénico (de campo ou vacinal) levam tempo a produzir anticorpos suficientes para serem detectados por ELISA (geralmente pelo menos 2-4 semanas após a exposição, dependendo do agente patogénico e do anticorpo que procuramos).
  • Os testes de anticorpos ELISA não conseguem diferenciar entre anticorpos maternos (passivos) e anticorpos mediados pela exposição (activos).
  • Os anticorpos ELISAs muitas vezes não conseguem diferenciar os anticorpos produzidos por uma vacina dos produzidos pela exposição a uma estirpe de campo.
  • Em alguns casos, podem ser desenvolvidos testes especiais ELISA, que permitem a diferenciação entre animais infectados e vacinados (se forem utilizadas vacinas DIVA).
  • Os resultados dos anticorpos ELISA não implicam protecção. A protecção pode vir de diferentes anticorpos, que não são necessariamente os medidos no teste, ou da imunidade mediada por células, que é completamente diferente da imunidade humoral, ou mediada por anticorpos, e não é medida por um teste ELISA.
  • O antigénio ELISA é significativamente menos sensível (baixa sensibilidade analítica) na detecção de antigénios em comparação com uma PCR. A PCR replica activamente o ADN/RNA presente, para que possa detectar quantidades extremamente baixas de vírus ou bactérias. Por outro lado, o antigénio ELISA requer uma concentração significativamente mais elevada de vírus ou bactérias para poder criar uma mudança de cor detectável.
  • Ao utilizar ELISAs comerciais (fáceis de encontrar e utilizar), os resultados são normalizados e geralmente consistentes entre laboratórios. Os testes ELISA internos podem produzir uma grande variabilidade de resultados, a menos que o seu protocolo de produção seja altamente normalizado e rigorosamente seguido.
  • Nem todos os agentes patogénicos produzem uma resposta imunitária mensurável.
  • Tipicamente, diferentes kits ELISA analisarão proteínas diferentes, que podem produzir resultados muito diferentes para a mesma amostra. Um exemplo claro são as grandes diferenças nos kits de detecção de anticorpos para Mycoplasma hyopnemoniae; claramente, nem todos os kits são criados de forma igual.
  • A dose e/ou via de exposição pode afectar o nível de resposta imunitária (nível de produção de anticorpos).
  • É importante conhecer a sensibilidade do teste (capacidade de detectar verdadeiros positivos) e a sua especificidade (capacidade de identificar verdadeiros negativos como negativos; sem reactividade cruzada).
    Podem ocorrer falsos positivos e falsos negativos porque a quantidade de exposição e resposta imunitária a agentes patogénicos varia entre porcos individuais (distribuição normal) e há frequentemente antecedentes ou reactividade cruzada que não podem ser completamente eliminados (ver figura 1).
  • Os anticorpos ainda estão normalmente presentes/detectáveis durante vários meses após a exposição/vacinação.

Figura 1. Diagrama que demonstra o ponto de corte estabelecido para um ELISA. A curva azul representa uma distribuição normal de animais negativos. A curva laranja representa uma distribuição normal de animais expostos. A área para falsos positivos e falsos negativos é indicada.

Figura 1. Diagrama que demonstra o ponto de corte estabelecido para um ELISA. A curva azul representa uma distribuição normal de animais negativos. A curva laranja representa uma distribuição normal de animais expostos. A área para falsos positivos e falsos negativos é indicada.

Resultados negativos

  • Amostra/exploração realmente negativa para o agente patogénico (sem exposição ou vacinação).
  • A amostra da exploração é verdadeiramente negativa para o agente patogénico, embora os animais possam ter sido vacinados (se o teste tiver capacidade DIVA) (apenas ELISA para anticorpos)
  • Não há antigénio suficiente presente na amostra para a detecção (apenas teste ELISA de antigénio)
  • A amostra foi colhida demasiado cedo e o porco ainda não foi capaz de gerar uma resposta imunitária (apenas anticorpos ELISA).
    • PRRS requer frequentemente 7-10 dias para a seroconversão
    • A Lawsonia intracellularis requer frequentemente 4-6 semanas para a seroconversão, dependendo da dose de exposição
  • Amostra tirada demasiado tarde e o agente patogénico já não está presente
    Vírus da gripe apenas presente nas secreções nasais durante os primeiros 3-4 dias
  • Estamos à procura do anticorpo/antigénio errado
    • Diferentes estirpes de gripe (diferenças entre H1N1 e H3N3 e também entre diferentes clades de H1N1)
  • Baixa prevalência na exploração e animal(is) amostrado(s) foi negativa
    • Necessidade de aumentar o número de animais amostrados
    • Uma determinada doença pode não estimular anticorpos suficientes para a detecção
    • Mycoplasma hyopneumoniae adere principalmente à cílios pulmonares e não estimula a produção elevada de IgG sérica
    • Infecção de campo recente produz resultados muito mais fortes com ELISA.
    • As vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae não estimulam uma forte resposta imunitária IgG
  • Diferentes testes ELISA detectam vacinas de forma diferente
    • Tipicamente, apenas 30% dos animais vacinados são seroconvertidos
    • Uma amostra fracamente positiva será diluída se for combinada com outras amostras.
  • É fortemente recomendado NÃO juntar amostras!

Amostra positiva

  • Amostra/exploração realmente positiva para exposição ao agente patogénico
  • Incapaz de diferenciar se a amostra é infecciosa ou não-infecciosa
  • Incapaz de diferenciar os anticorpos maternos da exposição natural ou da vacinação.
    • A maioria dos anticorpos maternos desaparecem às 8-12 semanas de idade
    • À medida que os porcos envelhecem, os valores ELISA devem reduzir-se significativamente.
    • Podem ser feitos testes em série para confirmar o desaparecimento de anticorpos maternos, bem como a falta de exposição a estirpes de campo (sem novas infecções).
  • Dependendo do agente patogénico que procuramos, a detecção da proteína (antigénio/anticorpo) nem sempre confirma a doença.
    • Soro que testa positivo para o vírus de circulação suíno tipo 2 (PCV2) por anticorpos ELISA confirma a exposição ao PCV2, seja por vacinação ou infecção (ambos os casos são bastante frequentes) mas não confirma se a deficiência é atribuível ao PCV2 ou se ocorreu uma falha de vacina. A imunohistopatologia do tecido pulmonar e/ou linfóide deve ser realizada para demonstrar a doença associada ao PCV2.
  • O teste pode não ser capaz de diferenciar a exposição a vírus/bactérias vacinais de uma vacina viva modificada de uma infecção de campo (apenas anticorpos ELISA).
    • Aplicável tanto a vacinas vivas mortas como a vacinas vivas modificadas.
    • O tempo de aplicação da vacina é útil, embora não crítico, pois os animais podem permanecer positivos para algumas doenças durante um longo período de tempo (muitos meses).
  • As contaminações cruzadas são improváveis, uma vez que é necessária uma grande quantidade de contaminação para produzir um resultado positivo (depende da concentração).
Figura 2. Valores ou títulos de ELISA após a imunização.

Figura 2. Valores ou títulos de ELISA após a imunização.

  • Um simples valor ELISA pode não ser capaz de identificar completamente a fase da infecção (é necessário um historial clínico, ver figura 2).
    X = valor ELISA
  • Há três pontos diferentes num surto que podem produzir o mesmo valor ELISA, mas a interpretação e as acções a serem tomadas seriam bastante diferentes:
    • Ponto A - Início da infecção - o surto está a começar; podem ser tomadas medidas.
    • Ponto B - Fim da infecção - o surto está a terminar; já não se pode fazer muito.
    • Ponto C - Segundo surto - está a começar um segundo surto. As medidas de biossegurança ou as causas do surto devem ser examinadas.
  • Uma segunda amostra dos mesmos animais pode ser necessária após 10 dias - 2 semanas para finalizar a fase (juntamente com a história clínica).
    • Se os resultados do segundo teste forem mais elevados, estamos provavelmente no ponto A.
    • Se os resultados do segundo teste forem muito superiores, estamos provavelmente no ponto C.
    • Se os resultados do segundo teste não mudarem, estamos provavelmente numa fase de planalto.
    • Se os resultados do segundo teste diminuírem, estamos provavelmente no ponto B.
  • Valores S:P elevados podem frequentemente estar associados a exposição mais recente
    • Especialmente após uma segunda exposição ou vacinação de reforço (ver Figura 2) (apenas anticorpos ELISA).
    • É importante notar que só porque uma infecção é recente não implica que o agente patogénico ainda esteja presente (ou seja, o animal é viraémico ou bactremico) (apenas anticorpos ELISA).
      • Isto é especialmente verdade para o vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória do Porco (PRRS).
      • Os porcos podem ser ELISA negativos e ainda ser viremicos.
      • Os porcos podem ter valores elevados de anticorpos no ELISA e ainda não ser viremicos.
      • A PCR é utilizada para estabelecer o nível de viraemia nos animais.
  • Valores S:P baixos
    • Uma determinada doença pode não ser estimulante o suficiente para a detecção de anticorpos
    • Mycoplasma hyopneumoniae liga-se principalmente à cílios pulmonares e não estimula a alta produção de IgG sérica.
      Infecção de campo recente produz resultados ELISA mais fortes.
    • As vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae não estimulam uma forte resposta IgG
    • Diferentes testes ELISA detectam vacinas de forma diferente
    • Tipicamente, apenas cerca de 30% dos animais vacinados seroconvertem
    • Os porcos tratados com antibióticos durante várias semanas podem suprimir o crescimento bacteriano durante este período, diminuindo a exposição à doença (mas não eliminando-a), levando a uma resposta imunitária menor ou mais fraca à exposição.
    • Utilização de antibióticos contra Mycoplasma hyopneumoniae precoce ou de transição média
    • Utilizar antibióticos contra agentes patogénicos entéricos, tais como Lawsonia intracellularis precoce ou de transição média.

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