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Os testes baseados na detecção de ácidos nucleicos tornaram-se o teste de eleição para detectar a presença de agentes patogénicos em amostras de diagnóstico. A reacção em cadeia da polimerase ou PCR é um procedimento de testagem de ácidos nucleicos amplamente utilizado em laboratórios de diagnóstico e investigação. A PCR é um procedimento que amplifica um fragmento minúsculo de ADN até ao ponto de ser detectável como uma banda numa tira de gel ou como um sinal fluorescente detectável com uma máquina e que pode ser realizado em poucas horas. Uma boa PCR requer um investimento significativo em equipamento como termocicladores, um laboratório especializado e pessoal formado e experiente.
O que é o método LAMP?
LAMP (pelas suas iniciais em inglês Loop-mediated isothermal amplification) é um método simples, rápido, sensível e exacto de detecção e amplificação de ADN/ARN que não requer equipamento sofisticado e é relativamente barato. A reacção é realizada num tubo de microcentrifugação. O equipamento necessário para o método LAMP é simples: uma pipeta, pontas de pipeta descartáveis e um banho seco digital. Um banho de água ou uma incubadora comum, ou mesmo garrafas térmicas com água quente, podem ser suficientes como fonte de calor, mas para facilitar a higiene laboratorial recomenda-se vivamente um termobloco digital (Figura 1).
Figura 1. Banho seco digital para tubos de microcentrifugação - adequado para LAMP. Fonte: Thermo Fisher Scientific Inc.
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Numa aplicação LAMP típica, a mistura do tubo de ensaio conterá:
- Seis fragmentos de ADN chamados primers que correspondem à sequência de ADN a ser detectada.
- Uma enzima polimerase específica (por exemplo, BST DNA polimerase).
- Soluções tampão
- Reagentes de apoio
- Um corante indicador (indicador de pH ou corante directo de ADN)
- Transcriptase inversa para vírus ARN
- A amostra a analisar.
Esta mistura é incubada a 60-65°C durante 30 minutos. Se a amostra contiver ADN correspondente aos primers, formam-se uma série de loops de ADN. Os loops tornam-se mais complexos e numerosos à medida que a reacção de amplificação prossegue (Figura 2).
Figura 2. Formação de laços de ADN na reacção da polimerase em LAMP. Fonte: Alhassan et al. 2015.
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A amplificação da polimerase produz, como subproduto, pirofosfato de magnésio que provoca turvação no tubo (opacidade). Os corantes indicadores que se ligam directamente ao ADN produzem um sinal fluorescente no espectro visível ou UV. Um sistema LAMP que utilize um indicador de pH vermelho de fenol muda de vermelho-rosado para amarelo.
A figura 3 mostra o resultado de um ensaio LAMP para a Peste Suína Africana (PSA) - o tubo A continha um extracto do baço de uma porca morta por PSA. O elevado teor de ADN viral gera uma cor amarela opaca. O tubo B era uma zaragatoa de fluido oral da mesma porca, com a carga viral esperada mais baixa. A turvação nos tubos A e B é evidente quando se observa a linha inferior. Os tubos C a F são tubos suspeitos e negativos.
Figura 3. Tubos de microcentrifugação de um teste LAMP in situ num caso de PSA. A: baço de uma porca morta, B: fluidos orais da mesma porca (A), C-F: fluidos orais suspeitos e negativos.
Existem algumas variações da reacção LAMP, dependendo da tecnologia disponível. O teste pode ser efectuado em microplacas seladas de 96 orifícios com corantes colorimétricos ou fluorescentes ou medições de turbidez para obter um resultado quantitativo e automatizado. As fotocélulas filtradas no termobloco e um LED adequado podem também automatizar a leitura fluorescente semi-quantitativa em tempo real a partir de tubos de microcentrifugação. A espectrofotometria utilizando uma câmara de telemóvel pode resolver dúvidas sobre tubos suspeitos nos casos em que o olho humano não consegue resolver o dilema.
A reacção LAMP pode ser realizada no terreno, in situ, para obter resultados práticos "Point-of-Care" com um tempo de espera mínimo. O nosso laboratório construiu e verificou ensaios LAMP pouco dispendiosos (de "raiz" e a partir de kits) para a Peste Suína Clássica (PSC), o Circovírus Suíno 2 (PCV2) e a Peste Suína Africana (como acima referido). Procurámos validar a ideia (para a PSC) de que um lote de reprodutores poderia ser testado antes da introdução, de uma forma rentável, para detecção de infecção persistente, utilizando o método LAMP.
As vantagens do método LAMP são a rapidez dos resultados, a formação mínima necessária, o baixo investimento em equipamento, a pequena dimensão do laboratório e o baixo custo global por amostra. Embora os custos possam variar, o custo do método LAMP é cerca de metade do custo da PCR e é ainda mais reduzido para matrizes simples em que não é necessária uma extracção prévia de ácido nucleico. Os laboratórios dispostos a investir no desenvolvimento do método LAMP a partir do zero com reagentes relativamente baratos e conjuntos de "primers" criados pelo próprio laboratório podem evitar o custo mais elevado de um kit pronto a usar, mas enfrentam os custos associados ao desenvolvimento, verificação e certificação.
A sensibilidade e a especificidade do método LAMP são comparáveis à PCR e podem dar resultados em 30 minutos. Algumas administrações aprovaram kits comerciais de teste LAMP para a PSA e a Covid-19.
Entre as desvantagens do método LAMP inclui uma falta de conhecimento por parte de alguns académicos e investigadores e algum cepticismo em relação ao método. O LAMP requer 6 (até 8) iniciadores para cada gene a detectar e a obtenção de iniciadores é mais difícil do que a PCR convencional, mas estão disponíveis ferramentas on-line. No caso de vírus ARN altamente mutáveis, como o PRRS, podem ser necessários vários conjuntos de "primers" na mistura, mas este facto não impediu a sua utilização. O método LAMP gera muito DNA e os tubos positivos geralmente não devem ser abertos após o teste para evitar a contaminação do laboratório. Os amplicons LAMP não são facilmente adequados para uma sequenciação útil e o laboratório pode ter de recorrer à PCR convencional ou a outros métodos para amostras LAMP-positivas quando é necessária a sequenciação do vírus.
É fácil imaginar a aplicação do método LAMP em pontos de venda de gado, pontos de recolha de animais e matadouros, bem como em ambientes mais rudimentares e remotos onde não é possível deslocar equipamento sensível e dispendioso. Quando não existem instalações sofisticadas ou mesmo electricidade e as respostas binárias sim/não são essenciais para a tomada de decisões em tempo real e no local, a LAMP poderia ser uma solução. O baixo custo e a falta de equipamento podem ter dificultado, em certa medida, a proliferação da LAMP, uma vez que algumas empresas e laboratórios universitários podem preferir instalações mais dispendiosas, dando mais importância ao rendimento marginal do investimento do que ao custo efectivo dos serviços de análises veterinárias com base em taxas.
À medida que o mundo avança no sentido do controlo e da erradicação de doenças endémicas transfronteiriças importantes, como a Peste Suína Africana (PSA), a Síndrome Respiratória dos Suínos (PRRS) e a Peste Suína Clássica (PSC), a disponibilidade de um teste rápido, conveniente e acessível tem um grande potencial de utilização.
"Talvez ser demasiado prático seja uma loucura” - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Quijote.
