Será possível simplificar a congelação de sémen suíno?

Hoje, apesar dos esforços documentados para alcançar uma fertilidade e prolificidade aceitáveis após a IA,  a sobrevivência de espermatozóides suínos continua a ser baixa, devido aos danos produzidos durante um processamento relativamente antiquado que é lento (8-9 h), caro (necessita centrifugadoras refrigeradas, etc.) e que produz poucas doses por ejaculado (frequentemente apenas para 5-8 porcas com 2 IA/cio). O número de leitões nascidos continua a ser mais baixo que com sémen refrigerado ou puro, levando a que a vida útil dos espermatozóides, o local de deposição e a proximidade da ovulação conspirem contra o êxito do processo. Tudo isto faz com que o sémen congelado não seja uma alternativa na produção suína, ainda que seja necessário para os bancos de genes e a exportação.

Este artigo apresenta um processo alternativo baseado nas características in vivo do ejaculado, usando a primeira porção da fracção espermática do varrasco, apenas 10 ml, para congelar pequenas doses (de 0,5 ml cada uma), enquanto o resto dos espermatozóides ejaculados (mais de 75%) são usados para a produção rotineira de doses líquidas, combinando deste modo a produção e o armazenamento. A fertilidade / prolificidade destas pequenas doses congeladas/descongeladas é aceitável se for utilizada IA intrauterina profunda durante um cio espontâneo.

O que se sabe sobre o ejaculado

O ejaculado suíno consta de 3 fracções que podem ser diferenciadas visualmente durante a recolha manual: fracção pré-espermática (aquosa, com alguns coágulos gelatinosos, sem espermatozóides e com cerca 10-20 ml), a fracção espermática (mais densa, com espermatozóides, sem coágulos, com cerca de 30-50 ml) e a pós-espermática (outra vez aquosa, com coágulos e cerca de 150-200 ml). Os nossos estudos demonstraram que os espermatozóides contidos nos primeiros 10 ml da fracção espermática (também chamada pico espermático, que contém 15-20% de todos os espermatozóides, Fig 1) é mais resistente ao maneio (da diluição à refrigeração) e à criopreservação que o resto dos espermatozóides do ejaculado. Considera-se que o facto dos primeiros espermatozóides virem acompanhados por uma secreção específica (epidídimo/próstata), que contém proteínas associadas à fertilidade, explica a maior resistência ao maneio.

Figura 1: Um típico ejaculado de varrasco apresenta 3 fracções distintas dependendo –entre outros parâmetros– da concentração espermática (representada aqui com uma linha vermelha). O pico espermático costuma estar contido nos primeiros 10 ml da fracção espermática. Quando congelado, o pico espermático pode produzir 20 doses para IA intrauterina profunda, enquanto que o resto do ejaculado (a fracção espermática) ainda pode produzir umas 25 doses seminais líquidas para IA convencional.

O protocolo de congelação pode ser simplificado?

Normalmente a congelação utiliza toda a fracção espermática eliminando, por diluição e centrifugação nas centrifugadoras refrigeradas, o plasma seminal. Então, os espermatozóides do sedimento são diluídos de novo, refrigerados e congelados, com frequência em palhetas médias (2,5 ml) ou Flat-bags de 5 ml (Fig 2). As doses de IA costumam conter 5.000x10⁶ espermatozóides, pelo que um ejaculado produz um máximo de 16 doses para IA cervical (ou seja, 8 porcas a 2 IA/cio). Foi comparado sémen congelado da fracção espermática (controlo) com o do pico espermático (os primeiros 10 ml da fracção espermática) utilizando congelação convencional (CC) frente a um processo simplificado (CS). O sémen do pico espermático foi manejado em forma concentrada (900x10⁶ espermatozóides/dose) para um eventual uso em IA intra-uterina profunda (1-2 doses por cio, suficiente para 10 porcas). As células do pico espermático eram mantidas durante 30 minutos no seu próprio plasma seminal e depois, sem centrifugação (ou seja, sem extrair o plasma seminal), foram diluídos com lactose-gema de ovo (LEY, pelas suas siglas em inglês) e, durante 1,5 h, foram refrigerados até alcançar os + 5°C, antes de ser misturados com LEY+glicerol (3%) e OEP (Orvus ES Paste, um detergente sintético) e embalados em Mini Flat-bags de 0,5 ml (Fig 2). A congelação utilizada foi, em todos os casos, a uma taxa de arrefecimento de 50°C/min. O processo simplificado completo (CS) durou 3,5 h em comparação com a congelação convencional (CC) que durou 8 h; ambos tiveram uma criosobrevivência igualmente boa (mais de 60% das células processadas).

Figura 2: Representação esquemática das principais diferenças entre as mini-palhetas plásticas de 0,25 ml, com Flat-bags simples (5 ml) e múltiplos (de 0,5-0,7 ml). À direita apresenta-se uma fotografia de um Flat-bag  cheio e selado), cortesia do Dr. Fernando Saravia).

Quais são as vantagens que tem?

Várias; utilizando este protocolo simplificado e mais curto não é necessário o uso de centrifugadoras refrigeradas. Por outro lado, a variação intra-macho é minimizada utilizando espermatozóides da primeira porção (P1) que não só são os "melhores" para ser criopreservados, mas também é utilizada a parte da fracção espermática onde está documentado que se encontram as proteínas associadas à fertilidade. Finalmente, este procedimento libera o resto dos espermatozóides recolhidos (75-80% da contagem total) para um processamento adicional de umas 25 doses para IA convencional (Fig 1). Este protocolo simplificado pode ser uma alternativa interessante em centros de inseminação para –usando o mesmo ejaculado– congelar sémen suíno para armazenamento, repovoamento ou distribuição comercial e produzir doses para IA convencional com sémen líquido, usando o resto do ejaculado. Este processo não interfere na rotina de maneio dos varrascos nem dos seus ejaculados.

Mas estas doses tão pequenas (0,5 ml, 500x10⁶ espermatozóides) são férteis?

Sim, aceitavelmente férteis, inclusive após uma única IA intrautrina profunda num cio espontâneo. As inseminações intrauterinas profundas duplas (às 24 e 36 h após a detecção do reflexo de imobilidade) feita em 120 porcas (de segundo parto) com sémen do pico espermático congelado como foi descrito mais acima (CS), produziu 42 % de partos com 8 leitões vivos por ninhada. As doses complementares de sémen líquido (2,3 x 109 espermatozóides) produziram cerca 80% de partos, com 13 leitões vivos por ninhada (M Wallgren, resultados não publicados). Apesar de não ser uma alternativa frente ao sémen líquido para uso comercial, esta técnica de congelação é uma boa opção para os bancos de genes e controlos de biossegurança sem interferir na produção de doses comerciais líquidas ou no maneio dos varrascos.