Técnicas de diagnóstico de PRRS: eleição da melhor estratégia para cada cenário

Os diagnósticos do PRRS evoluíram ao longo dos anos e incluem várias opções valiosas de teste.

O tipo de animais a serem amostrados e o tipo de procedimento de amostragem dependem do cenário para o qual o teste é realizado. Devem ser analisadas porcas, leitões, animais de engorda ou todos eles? Está a ser realizada uma amostragem direccionada ou aleatória da população? Qual deve ser o tamanho da amostra? Também deve ser decidido o tipo de amostra: recolha de soro, tecidos, fluidos orais ou sémen?

E, finalmente, não podem ser esquecidas todas as questões relacionadas ao estágio da doença no momento da amostragem. Quando é que apareceram os sinais clínicos? É esperado que o teste de diagnóstico detecte o vírus, identifique a lesão ou detecte anticorpos?

Por fim, é essencial entender as vantagens e limitações de cada teste de diagnóstico.

Compreender as opções e escolher a estratégia de diagnóstico correcta para cada cenário para o qual é necessário amostrar para o PRRS aumentará a eficácia de qualquer programa de saúde na exploração.

Cenários nos quais se recolhem amostras de PRRSV

O cenário mais óbvio é para investigar a doença, quando os sintomas de um possível surto de PRRS aparecem numa exploração negativa ou estável. Neste caso, os veterinários realizam o teste para compreender a causa dos sinais clínicos e a origem do agente patogénido que causa os problemas. Outro cenário muito comum é quando se monitoriza a ausência de PRRS numa exploração previamente positiva e instável que empreendeu uma estratégia de controlo ou erradicação e quer analisar o seu progresso. Finalmente, os testes de PRRS são extremamente comuns para fins de vigilância de doenças. Neste último cenário, os testes são realizados em explorações negativas e normalmente requerem um maior número de amostras para maximizar a confiança do estado livre de PRRS da população.

O tipo de testes será guiado pelos objectivos de diagnóstico

Historicamente, os testes de diagnóstico de PRRS têm sido classificados em 3 tipos:

1. As que detectam a lesão: observações post mortem e histopatologia, que apenas podem ser realizadas num laboratório com um microscópio. Os testes de detecção de lesões são usados com maior frequência nos surtos de PRRS clinicamente óbvios.

2. Os que detectam o vírus: reacção em cadeia da polimerase (PCR), isolamento do vírus (VI) e testes de imunohistoquímica (IHC). A detecção viral é a ferramenta de diagnóstico mais fiável para a confirmação precoce da presença de vírus.

3. Os que detectam anticorpos: Ensaio de imunoabsorção ligado a enzimas (ELISA), ensaio imunoperoxidase em monocamada (IPMA) e ensaio de imunofluorescência indirecta (IFA). A confirmação imunológica do contacto com PRRSV requer um periodo de detecção mais prolongado, mas confirma a exposição quando o vírus não consegue ser detectado.

As características do teste determinam o seu valor

É muito importante verificar a SENSIBILIDADE (SE) e ESPECIFICIDADE (SP) ao considerar qualquer teste de diagnóstico. Conhecer esta informação ajuda a interpretar e agir adequadamente sobre os possíveis resultados.

• SE: é a capacidade de um teste de diagnóstico para identificar correctamente amostras realmente positivas. Um teste com uma baixa SE terá muitos resultados falsos negativos.
• SP: é a capacidade de um teste de diagnóstico para identificar correctamente amostras realmente negativas. Um teste com uma baixa SP terá muitos resultados falsos positivos.

Opções de diagnósticos em função do cenário de PRRS

Todos os cenários e as opções de diagnósticos estão resumidas na tabela 1.

1. Investigação de surtos: Numa exploração em que surja um surto, o objectivo do protocolo de diagnóstico será confirmar a infecção e, se possível, caracterizar geneticamente a estirpe. A participação precoce do veterinário no surto ajudará a conseguir estes objectivos de maneira eficaz. Se houver porcos com sinais clínicos clássicos, é recomendado realizar uma amostragem selectiva destes animais para procurar lesões macroscópicas. Despois de identificar lesões representativas (ou seja, pulmões pesados não colapsados com aparência marmórea) na exploração, deve ser realizada uma PCR e histopatologia para confirmar o diagnóstico. De seguida, deveria ser realizada a sequenciação genética para identificar a estirpe. A sequenciação é a chave para compreender a epidemiologia (ou seja, origem, residente ou emergente) do possível novo vírus através da comparação com outras estirpes conhecidas.

2. Monitorização da doença: Para minimizar o impacto negativo da doença devido à instabilidade da produção numa exploração PRRSV positiva, devem ser implementados, o quanto antes, programas de controlo (seguidos algumas vezes pela erradicação) para produzir leitões negativos. Os objectivos do programa de diagnóstico, neste caso, serão demonstrar parâmetros chave que indicam a estabilidade do PRRS (ou seja, a aclimatação da reposição, a imunidade da exploração de porcas e a produção de leitões negativos). A serologia é usada para confirmar uma boa exposição da exploração de reprodutoras e a PCR é usada para confirmar a ausência do vírus em leitões recém-nascidos e desmamados. Nestas condições, são utilizados testes com uma alta SE (ou seja, a menor quantidade de falsos negativos possível). Uma vez que se trata de uma exploração onde a prevalência esperada de leitões positivos a PRRS é muito baixa ou ausente, é necessária uma grande quantidade de amostras para confirmar o estado do PRRS com um alto grau de confiança. Supondo a ausência de leitões clinicamente afectados, os leitões seleccionados ao acaso e as nulíparas negativas recentemente introduzidas dentro da exploração são as melhores populações para realizar a amostragem. A maioria dos tipos de amostra (ou seja, soro, fluídos orais, fluídos de processamento e tecidos) são valiosos, mas é importante compreender as diferenças de SE e SP entre os testes ao avaliar os resultados. Quando for possível, deve ser sempre considerada a agregação de amostras (“pooling”), para que a análise seja mais exacta.

3. Vigilância da doença: Para realizar a vigilância da doença em explorações negativas, são frequentemente seleccionados testes com a SP mais alta (ou seja, a menor quantidade de resultados falsos positivos) que seja possível. Estas explorações (exemplo, centros de inseminação ou multiplicadores), em muitas ocasiões, devem documentar o seu estado de forma rotineira. No caso das explorações de porcas, o teste ELISA é a melhor opção para provar a ausência de exposição ao PRRSV. É acessível, rápido e tem uma boa SE e SP. É comum que estas explorações façam um teste serológico secundário para determinar se os seus resultados positivos inesperados (normalmente de 1 a 2% das amostras totais) são positivos verdadeiros ou falsos. A prova indirecta de anticorpos de fluorescência (IFA) ou o ensaio de monocamada de imunoperoxidase (IPMA), ambas baseadas na tinção indirecta de monocamadas preparadas em células infectadas, servem como provas de confirmação comuns para positivos inesperados ao ELISA. A PCR como teste de detecção precoce é usada em: 1) fluídos orais antes da entrega das porcas de substituição de maior idade e 2) amostras de soro ou sangue de varrascos em centros de inseminação.

Como resumo, ao eleger os testes correctos, no momento correcto, nos animais correctos e interpretá-las correctamente aumentará a velocidade, precisão e rentabilidade das estratégias de diagnóstico de PRRS.

Tabela 1. Resumo dos cenários e estratégias por diagnóstico

Investigação de um surto

1. Estatuto a PRRS da exploração
   • Instável a PRRS
   • Transmissão activa do vírus
   • Nova introdução de PRRSV
   • Alta prevalência da doença
2. Objectivos do diagnóstico
   • Detecção da infecção
   • Identificação da estirpe de PRRSV
3. Animais
   • Aqueles com sintomatologia clínica
   • Nascidos mortos
4. Tipos de amostragens
   • Amostragem dirigida
   • Menor número de animais
   • Amostras agrupadas (“pooled”)
5. Amostras
   • Tecido
   • Soro
6. Primeira opção de diagnóstico
   • Necrópsia para identificar a lesão
   • Prós
     • “Muito rápido”
     • Na exploração
     • Não é caro
   • Contras
     • SE/SP baixa
7. Segunda opção de diagnóstico
   • PCR/sequenciação de vírus para detectar/identificar a estirpe de PRRSV
   • Prós
     • SE/SP alta
     • Rápida, 24h
     • Os resultados podem ser quantificados (RT-qPCR)
   • Contras
     • Casos potenciais de falsos positivos devido a contaminação cruzada: assegurar um maneio da amostra correcto (durante a amostragem e o processamento).

Monitorização da doença

1. Estatuto a PRRS da exploração
   • Estável a PRRS
   • Estirpe PRRS autóctone da exploração
   • Prevalência baixa da doença
2. Objectivos do diagnóstico
   • Monitorização da estabilidade / controlo
   • Monitorização de programas de erradicação
3. Animais
   • Leitões (recém-nascidos e desmamados)
   • Reposição
4. Tipos de amostragens
   • Amostragem aleatória/Número alto de animais
   • Amostragem dirigida/Número menor de animais
   • Amostras agrupadas (“pooled”)
5. Amostras
   • Fluídos orais
   • Soro
   • Fluídos das caudas (processados)
   • Fluídos de línguas de leitões
6. Primeira opção de diagnóstico
   • PCR para detectar o antigénio (RNA) desde ≈7 dias pós-infecção
   • Prós
     • SE/SP alta
     • Rápida, 24h
     • Os resultados podem ser quantificados (RT-qPCR)
   • Contras
     • Casos potencialmente falsos de positivos devido a contaminação cruzada: assegurar um correcto maneio da amostra (durante a amostragem e o processamento
7. Segunda opção de diagnóstico/opción alternativa
   • ELISA para detectar anticorpos (IgM, IgG, N) desde ≈14 dias pós-infecção
   • Prós
     • Baixo custo por amostra
     • Resultados em 2-4 dias
     • Confirmação laboratorial da ausência de exposição ao vírus
   • Contras
     • SP baixa
     • Não consegue diferenciar entre exposição a vírus por vacina e vírus de campo
     • Não se conseguem quantificar os resultados

Vigilância sanitária

1. Estatuto a PRRS da exploração
   • Exploração negativa a PRRSV
2. 1. Objectivos diagnósticos
   • Assegurar o estatuto negativo
3. Animais

Porcas Nulíparas/Leitões Reposição 4. Tipos de amostragem Amostragem aleatória Elevado número de animais Amostras agrupadas (“pooled”)	Varrascos de IA 4. Tipos de amostragem Amostragem aleatória Elevado número de animais Amostras agrupadas (“pooled”) Amostragem selectiva
5. Amostra Soro Cordas	5. Amostra Soro Zaragatoas sanguíneas
6a. Primeira opção de diagnóstico (porcas, nulíparas e leitões) ELISA para detectar anticorpos (IgM, IgG, N) desde ≈14 días pós-infecção Prós Baixo custo por amostra Resultados em 2-4 dias Confirmação laboratorial da ausência de exposição ao vírus Contras Menor SP Não consegue diferenciar entre exposição a vírus por vacina a vírus do campo Não se conseguem quantificar os resultados 6b. Primeira opção de diagnóstico (reposição) PCR para detectar o antigénio (RNA) às 72 horas pós-exposição Prós SE/SP alta Menos de 24h Conseguem quantificar-se os resultados (RT-qPCR) Contras Potenciais falsos positivos devido à contaminação cruzada: assegurar um bom maneio das amostras (durante colheita e o processamento) 7. Segunda opção de diagnóstico IFA/IPMA para detectar anticorpos (IgM, IgG) a partir dos ≈14 dias pós-infecção Prós SP alta Resultados em 4 dias Para confirmar falsos positivos do ELISA Conseguem quantificar-se os resultados Contras SE variável Os resultados dependem das capacidades do técnico de laboratório	6. Primeira opção de diagnóstico PCR para detectar antigénio (RNA) às 72 horas pós-exposição Prós SE/SP alta Menos de 24h Os resultados podem ser quantificados (RT-qPCR) Contras Potenciais falsos positivos devido à contaminação cruzada: assegurar um bom maneio das amostras (durante colheita e o processamento)